改进CAR-T细胞有效性和安全性的设计策略

　　嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞的概念最早于1989年提出，CART细胞结构主要包括三部分，即：胞外区域、穿膜区域和胞内区域。根据胞内共刺激分子的不同，可以将CAR-T细胞分类为一代CAR-T细胞（不包括共刺激分子）、二代CAR-T细胞（包括一个共刺激分子）和三代CAR-T细胞（包括两个共刺激分子）。CAR-T细胞在B细胞恶性肿瘤上取得良好的临床治疗效果，特别是复发难治的急性淋巴细胞白血病（ALL）。

　　目前CART细胞所针对的靶点在多数正常组织也有表达，如何找到特异性的靶点以及通过结构的优化，提高对肿瘤的杀伤效率，降低CAR-T细胞对正常组织的损害是CAR-T细胞面临的一大挑战。CAR-T细胞发挥免疫杀伤作用，依赖CAR-T细胞和肿瘤细胞相互接触，并需克服肿瘤局部免疫抑制微环境。由于实体瘤往往伴随有成纤维细胞包裹瘤体，在肿瘤微环境中存在大量的免疫抑制细胞、因子和调控分子，如何使CAR-T细胞迁移到肿瘤部位，克服肿瘤免疫抑制微环境，发挥CAR-T细胞杀伤作用则是将CAR-T细胞治疗技术全面推向临床应用的另一大挑战。进入患者体内的CAR-T细胞与肿瘤细胞接触，会在短时间内大量扩增，导致免疫细胞的活化、扩增和细胞因子的大量释放很可能导致致命性的细胞因子释放综合征（CRS）——发热、昏迷、血压降低，甚至多器官衰竭综合征。虽然可以使用糖皮质激素控制住CRS的副作用，但是糖皮质激素的使用也会影响CAR-T细胞的增殖，从而影响疗效。CAR-T细胞的副作用还需要通过优化CAR-T细胞的结构设计来从根本上消除。本文主要围绕如何通过CAR-T细胞的结构设计从而提高其有效性和安全性这两部分进行分析与讨论。

　　一、增强CAR-T细胞有效性的设计

　　1.  反转免疫抑制信号的设计

　　针对前列腺癌细胞高表达免疫抑制分子PD-L1的特点，反转抑制T细胞活性的抑制信号通路（PD1，PD-L1）为活化信号通路的设计——具体是在抗前列腺抗原PSAC的CAR-T基础上，再对CAR-T细胞转染另外一段基因序列，使之胞外区和穿膜区是PD1分子，胞内区是活化T细胞的CD28。高表达PD-L1的肿瘤细胞会对CAR-T细胞产生免疫抑制作用，但是反转免疫抑制信号的CAR-T细胞，将会克服PD1和PD-L1接触后的免疫抑制作用，使免疫抑制信号变成活化信号，增强了CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用，同时还促进CAR-T细胞Th1类细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-12等）的分泌，在一定程度上改善了肿瘤局部免疫抑制的微环境。这样的结构也可以针对其他的免疫抑制信号（CTLA-4等）进行设计，详见图1A。

　　2.  可分泌PD-L1单抗的CAR-T细胞

　　在二代CAR-T的结构基础上再加上一段能分泌PD-L1单抗的基因序列，使CAR-T细胞在与肿瘤细胞接触过程中不仅能杀灭肿瘤细胞，并且局部分泌的PD-L1单抗与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。有研究者针对羧基脱水酶Ⅸ（CAⅨ）这个靶点设计出能分泌PD-L1单抗的CAR-T细胞，PD-L1单抗和肿瘤细胞的结合不仅在一定程度上解除了免疫抑制——下调CAR-T细胞免疫抑制分子的表达（PD-1、TIM3、LAG3），同时还上调了NK细胞对肿瘤细胞的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）作用，增强CAR-T细胞杀伤肾癌细胞的效率。美国加州大学旧金山分校的研究人员构建出能够在体内执行一系列可定制反应的免疫细胞，可以将药物或者其他治疗载体运送到肿瘤或其他不正常的组织中。这些被称为SynNotchT细胞的免疫细胞可以高效地靶向肿瘤细胞，释放一种特定的抗体药物，将这套系统用到CAR-T细胞中，使得CAR-T细胞也可以分泌PD-L1单抗，从而改善免疫抑制的微环境，详见图1B。

　　3.  表达趋化因子的CAR-T细胞

　　抗GD2的CAR-T细胞治疗成神经细胞瘤，在此基础上增加另外一段趋化因子CCR2b。由于成神经细胞瘤细胞不仅表达肿瘤抗原GD2，而且还表达针对CCR2b的配体CCL2。因此，表达趋化因子的CAR-T细胞提高了CAR-T细胞对于肿瘤组织的迁移能力，使得CAR-T细胞和肿瘤充分接触，提高了CAR-T细胞的疗效。

　　4.  能自分泌IL-12的CAR-T细胞

　　IL-12属于Th1类细胞因子，它可以提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，但是全身使用IL-12会产生一些难以耐受的副作用和自身免疫疾病。构建的CAR-T细胞表达能分泌IL-12，使得CAR-T细胞在被激活时可自分泌IL-12，在一定程度上可以改善免疫抑制微环境，而且还可以使CAR-T细胞周围失活的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）受到IL-12的刺激被重新激活，从而增强免疫杀伤细胞其对肿瘤的杀伤作用。这种可以自分泌细胞因子并且刺激自身增殖的CAR-T细胞也称为武装的CAR-T细胞。

　　5.  双靶点串联的CAR-T细胞

　　尽管CAR-T019在治疗复发难治的B细胞恶性肿瘤上取得了良好的疗效，但是仍约有11%的患者在接受CART019的治疗后，产生了CD19-肿瘤的复发，故全面彻底清除掉B细胞肿瘤就显得极为重要。因此有研究者针对此设计了CD19和CD20（B细胞同时也高表达CD20）串联表达于T细胞表面的CAR-T细胞，既可以提高CAR-T细胞对于B细胞恶性肿瘤的杀伤能力，又减少CD19-的B细胞肿瘤的复发率，详见图1D。

　　二、提高CAR-T细胞安全性的设计

　　由于CAR-T细胞所针对的靶点多数在正常细胞也表达，因此CAR-T细胞在攻击肿瘤细胞的同时也会攻击正常细胞。抗Her2靶点的CAR-T细胞在治疗晚期结肠癌时患者就出现了致命性的急性呼吸衰竭综合征，其因为表达于肿瘤细胞表面的Her2也表达于正常的肺上皮细胞，因此输注的CAR-T细胞循环到肺时也产生了对肺上皮细胞的攻击。如何优化CAR-T细胞设计，使CAR-T细胞既可以特异性地杀伤肿瘤细胞又能在体内被系统性地控制，笔者总结了如何提高CAR-T细胞安全性的五种设计方法，其示意图如图2所示。

　　1.  安装自杀基因

　　目前针对CAR-T细胞的自杀基因常见的设计设计有以下三种，分别是：（1）疱疹病毒中的胸苷激酶（ZVZ-TK）——ZVZ-TK可以使得更昔洛韦转变成三磷酸更昔洛韦，从而诱导CAR-T细胞死亡；（2）Caspase-9可以被小分子化合物AP1903诱导二聚化，从而启动CAR-T细胞的凋亡通路；（3）CAR-T细胞同时表达EFEα，当出现不可控制的副作用时，给患者输注针对EFEα的单抗，就会出现EFEα抗体诱导的ADCC效应，使CAR-T细胞被清除。给CAR-T细胞安装自杀基因的目的是通过清除CAR-T细胞来发挥作用的，这样虽然控制了CAR-T细胞的副作用，但也清除掉CAR-T细胞。

　　2.  通过特异性抗体和CAR-T细胞的偶联来控制

　　CAR-T细胞和肿瘤细胞结合通过特异性抗体［一端是抗肿瘤抗原的Fab端，另一端是PNE端］和CART细胞（CAR可与PNE端结合）结合的方法来控制CAR-T细胞的安全性。当CAR-T细胞和这种特异性抗体同时给患者输注时，CAR-T细胞就能通过特异性的抗体和肿瘤细胞结合，达到杀伤肿瘤细胞的功能；当肿瘤细胞被清除以后，只要不再输注特异性的抗体，CAR-T细胞就不能再和肿瘤细胞结合发挥其对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤作用（由于CAR-T细胞中CAR的设计并不直接针对肿瘤细胞），详见图2A。

　　3.  双特异性的CAR-T细胞

　　上皮细胞肿瘤表达叶酸受体和间皮素受体，而正常细胞仅表达其中之一的抗原表位，设计将共刺激分子和CD3ζ链分别连接于不同肿瘤表位的双特异性的CAR-T细胞。其设计的原理是将其针对抗原表位之一的CAR连接于胞内段的共刺激分子，再将针对另外一抗原表位的CAR连接于CD3ζ链。当肿瘤细胞和双特异性CAR-T细胞结合后会激活共刺激分子和CD3ζ链，CAR-T细胞就会被激活去杀伤肿瘤细胞；而正常细胞只表达其中之一的抗原，那么只能活化共刺激分子或者CD3ζ，这样就不能完全活化CAR-T细胞，因而CAR-T细胞并不能杀伤正常的组织细胞，详见图2B。

　　4.  ICAR的设计

　　对于一些肿瘤细胞只特异性表达一种抗原表位，但是正常细胞表达这样的抗原表位之外还表达另外一种抗原表位。因此就有研究人员利用这一特性设计出抑制嵌合抗原受体（ICAR）细胞，它有两个scFv序列，其中之一是针对肿瘤细胞所设计的，其胞内段是活化被修饰T细胞活性的活化序列；另外一段scFv序列是针对正常组织的，其胞内段是抑细胞只表达活化被修饰T细胞的抗原表位，因此会激活ICAR细胞，从而杀伤肿瘤细胞；当时当ICAR细胞和正常细胞结合之后，就会产生抑制ICAR细胞活性的信号，因此ICAR细胞并不会被激活。通过这样的设计可以有效地避免脱靶效应，使得ICAR-T细胞只特异性地杀伤肿瘤细胞，详见图2C。

　　三、提高CAR-T细胞有效性和安全性的其他措施

　　肿瘤细胞有一定的异质性，而且肿瘤的发展也和肿瘤微环境是一个相互影响的过程，那么针对肿瘤的治疗也需要是一个综合立体化治疗的过程。CAR-T细胞的设计往往是针对肿瘤细胞的杀伤，但是真正的肿瘤微环境可能存在很多对于CAR-T激活不利的因素，因此联合可以改善免疫微环境的药物改善免疫抑制微环境就显得尤为重要。以下对研究热门的免疫检查点抑制药物和CAR-T细胞的联合使用，供者来源的T细胞制备CAR-T细胞，以及如何制备通用型的CAR-T细胞等问题进行讨论。

　　1.  CAR-T细胞和免疫检查点抑制剂的联合使用

　　CAR-T细胞和免疫检查点抑制剂联合使用可以减弱免疫抑制信号对于CAR-T细胞活性的抑制，有动物实验表明，抗HER2+的CAR-T细胞和PD-1单抗联合使用，其对肿瘤的杀伤作用强于单独使用CAR-T细胞，PD-1单抗封闭了T细胞的PDL-1，阻止了PD-1和肿瘤的PD-1结合，从而增强了CAR-T细胞的杀伤能力。同时还有研究发现，将治疗CLL的CD19CAR-T细胞和免疫调节药物依鲁替尼（ibrutinib）联用可以下调T细胞和肿瘤细胞上PD-1的表达，从而提高了CD19 CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的效果。

　　2.  供者来源CAR-T细胞的使用

　　对于移植后复发难治B细胞肿瘤可以采用供者来源的T细胞制备CAR-T细胞，对患者进行回输，达到治愈的目的。因为很多复发难治的B细胞肿瘤患者本身由于巨大的肿瘤负荷导致体内的免疫功能受损，其体内的T细胞也受到损害。患者自身的T细胞所制备CAR-T细胞难以有效扩增，细胞数也可能达不到入组条件的要求，从而影响疗效。根据美国国家癌症研究中心最近开展的临床试验表明：对于20例移植后复发的B细胞肿瘤患者，采用了供者来源的CAR-T细胞的治疗，其中共有6例患者获得了CR，2例患者获得了PR；5例ALL患者有4例取得了CR，同时还有1例慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者取得了30个月长期缓解。

　　异体的T细胞输注存在免疫排异的风险，但是抗病毒（CMV、EBV）特异性T细胞由于其T细胞主要表达抗病毒的TCR，所以降低了免疫排异的风险。因此用供者来源的抗病毒T细胞制备的CART细胞能避免免疫排异的风险。同时由于抗病毒特异性CAR-T细胞可以通过TCR和CAR两条信号通路刺激、活化、分泌细胞因子，因此其增殖优于一般的异体来源T细胞所制备的CAR-T细胞。有研究者利用最新的CRASP/Cas9技术将CAR的这段基因定点插入到原来T细胞的TCR位置，这样的设计避免了用逆转录病毒或者慢病毒随机插入的缺陷——有可能导致插入突变而致癌，同时也在一定程度上消除了异体T细胞输注到第三者的排异风险。同时由于这样制备的CAR-T细胞可以得到更加适当的刺激，所以其分化和扩增持续的时间要比传统的CAR-T细胞时间更长。

　　3.  通用型CAR-T细胞的制备

　　CAR-T细胞给恶性肿瘤的治愈带来了曙光，但稳定可靠的疗效，则依赖于规范标准化的CAR-T细胞制备。由于每个患者的基本情况不一样，所以很难获得均一性良好的T细胞，因此统标准的细胞来源以及制备工艺，是获得稳定可靠的CAR-T细胞的根本前提。目前对于CAR-T细胞的制备工艺分为病毒转染和非病毒转染，转染CAR的操作目前可以规范化操作，但是如何使每个患者所使用的细胞达到较好的均一性，则是目前的一个难题。有研究者采用NK-92细胞系来制备CAR-NK细胞，这样的方法可以获得均一性较好的免疫细胞，但是CARNK细胞也存在转染效率低以及在体内不能持续扩增等问题；也有研究者采用第三方的免疫细胞，然后用基因编辑技术将其改造成可以输注给患者使用的通用型CAR-T细胞（universalCAR-Tcells），但是其制备工艺相对复杂，安全性和有效性需要进一步的验证。因此，如何用最简单的工艺制备出安全有效的通用型CAR-T细胞还需进一步研究。

　　四、结语

　　CAR-T细胞可以直接执行特异性的肿瘤细胞杀伤，相比较其他免疫治疗的方法，CAR-T细胞能更快和更加明确地清除肿瘤细胞，并且不受T细胞识别杀伤肿瘤细胞的MHC分子识别的限制。但是目前而言，CAR-T细胞能针对的肿瘤主要还血液肿瘤和一部分淋巴瘤；CAR-T细胞输注到体内，不受控制地进行扩增，产生了一系列不良反应，最常见的为细胞因子释放综合征和脱靶效应。笔者主要从CAR-T细胞的结构设计上优化CAR-T细胞的性能，总结了国内外的研究进展，但是结构的优化只是CAR-T细胞设计中的其中一个视角。如何提高CAR-T细胞治疗的有效性和安全性是一个可以从多角度进行探索的问题，如何设计出最优的CAR-T细胞还需要细胞免疫治疗的同仁们共同努力来取得新的突破。

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